Определение IgМ-антител к Cytomegalie

Перевод теста CMV-IgM-ELA - Определение IgМ-антител к вирусу Cytomegalie.

ВВЕДЕНИЕ

Патогенный для человека цитомегаловирус (CMV) принадлежит к семейству Herpesviridae (герпесвирусов), которое отличается наличием двойного генома ДНК. Характерным для этих вирусов является тот факт, что после первичной инфекции они остаются в латентном состоянии в организме человека  на всю жизнь и может произойти реактивация.
Инфекции, вызванные CMV, у иммунокомпетентных людей протекают без особенностей. У людей с ограниченным иммунитетом (например, пациенты, перенесшие трансплантацию органов, инфицированные ВИЧ, пациенты с опухолями и новорожденные) наблюдаются различные осложнения.
Особое значение вирус CMV имеет как возбудитель пренатальных инфекций. Подобная инфекция может привести к серьезным последствиям для плода, которые нельзя исключать в дальнейшем, даже если ребенок родился без симптомов заболевания.
Тест CMV-IgM-ELA PKS medac предназначен для определения специфических IgM-антител к вирусу CMV в сыворотке человека.  Острую инфекцию, вызванную вирусом CMV, можно диагностировать с помощью результата IgM-антител. При этом необходимо помнить, что IgM-антитела образуются не всегда. Например, IgM-антитела к вирусу CMV у людей с пониженным   иммунитетом при реактивациях и повторных инфекциях наблюдаются крайне редко.                   

                  Принцып Теста

Микропланшет, покрытый античеловеческим IgM.

Частица IgM из сыворотки пациента связывается с микропланшетом.

Антитела  Anti-CMV-IgM  связывают  CMV-IgM-ELA, коньюгированный пероксидазой (AG = антиген, P = пероксидаза).

Инкубация с субстратом ТМВ (*). Реакция останавливается добавлением серной кислоты.  Результат считывается фотометрически.

Преимущества теста

• Отсутствие неспецифических реакций и ложноположительных результатов вследствие ревматоидных факторов.

• Отсутствие блокады  IgM-антител высоким IgG-титром.

• С помощью дозировочной системы контроля можно визуально перепроверить каждый шаг пипетки благодаря изменению цвета.

• Ломающиеся микротитровые стрипы обеспечивают оптимальное использование теста.

• Возможна автоматизация на открытых системах ELISA.

Содержимое упаковки KAT.- NR.: 110-PKS

1. (MTP) Микропланшет: 12 стрипов по 8 лунок (с рамкой и влагопоглотителем в запаянном вакуумном алюминиевом чехле), ломающихся, круглодонных, покрытых козьими античеловеческими IgM-антителами, BSA(альбумин бычьей сыворотки) и pH-индикатором, готов к использованию.
2. (CONTROL -) Отрицательный контроль: 1 флакон 1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к использованию, содержит альбумин бычьей сыворотки (BSA), фенол, ProClinTM 300 и гентамицина сульфат.
3. (CONTROL +) Положительный контроль: 1 флакон 1,5 мл, человеческая сыворотка, готов к использованию, содержит альбумин бычьей сыворотки (BSA), фенол, ProClinTM 300 и гентамицина сульфат.
4. (WB) Промывочный буфер: 1 флакон 100 мл, PBS/Tween (10x), pH 7,2 - 7,4, содержит ProClinTM 300.
5. (VIR-DIL) Буфер для разбавления проб:  1 флакон 110 мл,  PBS/Tween/BSA, pH 7,2 - 7,4, готов к использованию, содержит ProClinTM 300.
6. (ANTIGEN) CMV-IgM-ELA (фермент-меченый антиген): 2 флакона по 5,0 мл, лиофилизированный, содержит FKS, окрашен в красный цвет, HRP-коньюгированный.
7. (TMB) Субстрат ТМВ: 1 флакон 10 мл, готов к использованию.
8. (STOP) Стоп-раствор: 2 флакона по 11 мл каждый, 0,5 M серной кислоты (H2SO4), готов к использованию.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И СТАБИЛЬНОСТЬ

* Аликвотировать и после оттаивания повторно не замораживать.
Не использовать реагенты после истечения указанного срока годности.   

2.    ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ

2.1.    Aqua ad iniectabilia (вода для инъекций, бидистилированная H2O). Использование деионизированной воды может привести к ошибкам в системе теста.
2.2.    Микропипетки с изменяемым объемом.
2.3.    Чистые стеклянные или пластиковые сосуды для разведения промывочного буфера и проб.
2.4.    Соответствующее оборудование для промывания микропланшета (например, мультистеппер или вошер ELISA).
2.5.    Инкубатор с температурой 37 °C.
2.6.    Микропланшетный фотометр (ридер) с фильтрами на 450 нм и 620 -650 нм.                                                                   

3.    ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ

Перед началом теста все компоненты набора должны быть  доведены до комнатной температуры.
Посчитайте, сколько лунок вам  потребуется.

3.1. Микропланшет
Алюминиевый чехол с влагопоглотителем должен быть плотно закрыт после каждого отбора проб. Условия хранения и стабильность неиспользованных лунок указаны в пункте 1.
Примечание: лунки микропланшета имеют легкий зеленый оттенок. В некоторых случаях в лунках появляются зеленовато-коричневые пятна. Это обусловлено  производственным процессом и не влияет на результаты теста.

3.2.    Промывочный буфер
Одна часть промывочного буфера (10x) смешивается с девятью частями воды для инъекций (например, 50 мл промывочного буфера (10x) на 450 мл воды для инъекций). На восемь лунок потребуется 10 мл промывочного буфера.
Если в промывочном буфере (10x) присутствуют кристаллы, то перед составлением смеси их необходимо растворить при помощи нагревания  (макс. 37 °C) и/или размешивания при комнатной температуре.

3.3.    CMV-IgM-ELA
Лиофилизат разводится с помощью 5,0 мкл буфера для разбавления проб в каждом случае. Закрытые флаконы необходимо слегка встряхнуть, чтобы растворились частицы, прилипшие к пробке.
После разведения CMV-IgM-ELA поменяет цвет на красный и будет готов к использованию.
Реагенты, специально предназначенные для теста (микропланшет, контроли, CMV-IgM-ELA) нельзя смешивать с реагентами из других наборов (партий). В противоположность этому буфер для разбавления проб, промывочный буфер, субстрат ТМВ и стоп-раствор являются, как правило, взаимозаменяемыми для всех вирусологических тестов компании medac.
Не используйте реагенты других производителей.
Действительные и воспроизводимые результаты можно получить только при точном соблюдении технологической инструкции.

4.    МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1.    Тест подходит для изучения человеческой сыворотки.
4.2.    Сыворотки не требуют предварительной обработки (например, инактивации), тем не менее, они не должны быть заражены микробами и микроорганизмами или содержать эритроциты.
4.3.    Сыворотки разводят буфером для разбавления проб в пропорции 1:100. Для определения титра пробы можно разводить дальше.

5. A.  ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ИНСТРУКЦИЯ

5.1.    Откройте упаковку планшета, разрывая ее вдоль прорези, и достаньте необходимое количество стрипов с лунками (см. пункт 3.1.).
Лунки готовы к использованию и не требуют предварительной промывки.
5.2.    Лунка A1 остается свободной в качестве бланка  или контрольной лунки (см. пункт 6.A.). С помощью пипетки внесите в лунки микропланшета по 50 мкл проб, а также отрицательного контроля и положительного контроля в двойном определении  (в каждом случае).
После внесения проб (pH-нейтральные или базовые жидкости) цвет меняется на голубой/зеленый. Если в одной из лунок не происходит изменение цвета, это говорит о том, что в лунку не внесены проба или контроль.
При необходимости планшет можно поместить для дальнейшей обработки во влажную камеру максимум на 30 мин. при комнатной температуре или на 60 мин. при температуре 2 – 8 °C.
5.3.    Поместите лунки во влажную камеру или заклейте фольгой и инкубируйте в течение 60 мин. (± 5 мин.) при температуре 37°C (± 1 °C).
5.4.    Разведите  CMV-IgM-ELA (см. пункт 3.3.).
5.5.    После инкубации три раза промойте лунки  с помощью 200 мкл промывочного буфера (в каждом случае). Следите за тем, чтобы во время промывки все лунки были заполнены. После окончания промывки вытрусите лунки планшета на фильтровальную бумагу.
Не допускайте высыхания лунок! Используйте незамедлительно!
5.6. С помощью пипетки внесите во все лунки (кроме А1) CMV-IgM-ELA (окрашен в красный цвет).
При проведении теста вручную вносите по 50 мкл ELA в каждую лунку.  
Пожалуйста, обратите внимание:
При работе с автоматическими системами необходимо запрограммировать внесение 60 мкл ELA в каждую лунку по причине  более сильного испарения в инкубационных камерах.
Пригодность теста для автоматизированной обработки была продемонстрирована во время его валидации. Тем не менее, мы рекомендуем проверить совместимость теста с используемой вами системой.
5.7.    Поместите лунки во влажную камеру или заклейте фольгой и вновь инкубируйте в течение 60 мин. (± 5 мин.) при температуре 37°C (± 1°C).
5.8.    После инкубации промойте лунки микропланшета еще раз (см. пункт 5.5.).
5.9.    Внесите с помощью пипетки 50 мкл субстрата ТМВ в каждую лунку (включая А1), поместите во влажную камеру или заклейте фольгой и инкубируйте в темноте в течение 30 мин. (± 2 min) при температуре 37 °C (± 1 °C). Положительные пробы поменяют цвет на синий.
5.10. Остановите реакцию, добавив в каждую лунку (включая А1) по 100 мкл стоп-раствора (включая А1). Далее последует изменение цвета с синего на желтый.
Перед фотометрическим измерением необходимо протереть наружную поверхность лунок и проследить за тем, чтобы в них не было пузырьков воздуха.                                                                            
Измерение нужно провести в течение 15 минут после остановки реакции.  

5. Б. ТАБЛИЦА К ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ИНСТРУКЦИИ

*) ручная/автоматическая  обработка (см. пункт 5.6.)

6. A. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА (ВАЛИДНОСТЬ)

*    Фотометрическое считывание происходит при длине волны 450 нм (референс-волна 620-650 нм).
*    Оптическая плотность (ОП) контрольной пробы/бланка (лунка А1)вычитается из суммы всех значений ОП.
*    Среднее значение ОП отрицательного контроля должно быть < 0,100. Среднее значение ОП положительного контроля должно быть > 0,800.
*    Cut-off = СРЕДНЕЕ ЗНАЧЕНИЕ ОП ОТРИЦАТЕЛЬНОГО КОНТРОЛЯ + 0,140
*    Граничный интервал = Cut-off (точка разделения) ± 10 %
Если вышеперечисленные критерии валидности не соблюдены, тест необходимо повторить.

6. Б. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ/ПРЕДЕЛЫ МЕТОДА

*    Пробы с величинами ОП ниже граничного интервала засчитываются как ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ.
*    Пробы с величинами ОП в пределах граничного интервала засчитываются как ГРАНИЧНОЕ ЗНАЧЕНИЕ.   Эти величины необходимо контролировать и через 14 дней взять у пациента дополнительную пробу, которая будет исследована вместе с первой пробой на предмет изменения динамики титра.
*    Пробы с величинами активности фермента выше граничного интервала засчитываются как ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ.
*    Результаты теста должны всегда интерпретироваться с учетом клинической картины пациента и других диагностических параметров.
*    В некоторых случаях нельзя исключать перекрестные реакции, которые вызываются антителами против других герпесвирусов.
*    Сильно повышенное содержание липидов при отрицательных пробах может привести к получению ложноположительных результатов.
Высокие концентрации гемоглобина и билирубина не влияют на результаты теста.

7.    ХАРАКТЕРИСТИКИ
Следующие характеристики были получены нами в рамках диагностической оценки.

7. A. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ

В процессе диагностической опытной проверки с помощью теста CMV-IgM-ELA PKS medac были исследованы 482 пробы сывороток, полученных от доноров и пациентов. Результаты были сопоставлены с результатами высокоспецифичного контрольного теста  ELISA, проведенного в лабораторных условиях.  Результаты представлены ниже в таблице с 4 колонками.

Чувствительность  =  99.40 %

Специфичность    =  99.68 %

Прогнозированное положительное значение:  99.40 %

Прогнозированное отрицательное значение:  99.68 %

7.Б. ТОЧНОСТЬ

NK = отрицательный контроль; GW = слабоположительный контроль (не включен в набор); PK = положительный контроль

ОБЩИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ

*    Не путайте флаконы с реагентами и их крышки, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

*    Сразу же после использования плотно закрывайте флаконы с реагентами, чтобы избежать испарения и микробиологического заражения.

*    После использования реагенты необходимо хранить в соответствии с предписанными условиями, чтобы обеспечить указанный срок службы.

*    Чтобы избежать путаницы и смешения с реагентами другой тестовой системы или партии, все компоненты набора одного теста должны быть помещены сразу после использования в оригинальную упаковку (см. также пункт 3).
 

УКАЗАНИЯ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ

*    Соблюдайте общеобязательные государственные правила техники безопасности.

*    Реагенты, в которых использованы компоненты человеческого происхождения, были протестированы на наличие HBsAg, Anti-HIV 1/2 и Anti-HCV и признаны неинфицированными. Тем не менее, с такими реагентами, а также с реагентами, составные части которых имеют животное происхождение (см. «Содержимое упаковки»), необходимо обращаться как с  потенциально инфекционно-опасными, чтобы избежать риска заражения.
 

УКАЗАНИЯ ПО УТИЛИЗАЦИИ ОТХОДОВ

Химикаты и заготовки, содержащиеся в данном продукте, а также остатки, которые образуются при использовании данного продукта, относятся, как правило, к отходам, которые необходимо утилизировать в установленном законом порядке.

Утилизация таких отходов регулируется государственными законами и постановлениями. Информацию о местах и порядке утилизации предоставляют компетентные органы власти или предприятия, занимающиеся утилизацией отходов.

Дата выдачи: 01.07.2008

ЛИТЕРАТУРА

Ендерс, Г.: Инфекции и вакцинация в период беременности. Urban und Schwarzenberg, Мюнхен, 9-30 (1990).

Флик, Дж.: Сравнительный анализ двух количественных тестов ELISA, используемых для обнаружения IgG-антител к  HCMV (цитомегаловирус человека) у пациентов, перенесших трансплантацию органов. Плакат представлен на 5-той Международной конференции по вопросам диагностики и лечения заболеваний, вызванных цитомегаловирусом (1995).

Джетон, К., Доерр, Х. В., Вебер, Б.: Серологическая диагностика заболеваний, вызванных цитомегаловирусом: Оценка трех иммуноферментных анализов для определения специфических IgM-антител в пробах сывороток пациентов с нормальным и пониженным иммунитетом. Lab. Med. 20 (9), 480-484 (1996).

Раймер, K. и Майзель, Х.: Цитомегаловирус человека, в: Диагностическая библиотека, том 1, Порстманн, Т. (отв. ред.), Blackwell Wissenschaftsverlag, 279-290 (1996).

Шмитц, Х., Доерр, Х. В., Кампа, Д. и Вогт, A.: Иммуноферментный анализ с твердой фазой для определения IgM-антител к цитомпегаловирусу. J. Clin. Microbiol. 5, 629-634 (1977).

Шмитц, Х., Кампа, Д., Доерр, Х. В., Лютардт, T., Хилльманнс, Х. Г. и Вюртеле, A.: IgM-антитела к цитомегаловирусу в период беременности. Arch. Virol. 53, 177-184 (1977).

Шмитц, Х., фон Даймлинг, У. и Флеминг, Б.: Определение IgM-антител к цитомегаловирусу (CMV) с помощью фермент-мечеого антигена (ELA). J. Gen. Virol. 50, 59-68 (1980).

Штайнманн, Дж. и Бишофф, Дж.: Сравнительный анализ серологических методов для определения инфекции, вызванной цитомегаловирусом. Lab. Med. 15, 585-589 (1991).

Тённис, Р., Флик, Дж., Франке, Д., Метцгер, К., Даймингер, A., Бедер, У. и Ендерс, Г.: Сравнительный анализ трех методов, используемых для дифференциации первичной, повторной и долговременной инфекций, вызванных цитомегаловирусом у беременных женщин. Плакат представлен на 6-том Международном симпозиуме по вопросам  диагностики и лечения заболеваний, вызванных цитомегаловирусом, Orange Beach, AL, USA (1997).

Вебер, Б., Проссер, Ф., Мунквитц, A. и Доерр, Х. В.: Серологическая диагностика инфекций, вызванных цитомегаловирусом: сравнительная характеристика 8 иммуноферментных анализов для определения специфических IgM-антител к  HCMV. Clin. Diagn. Virol. 2, 245-259 (1994).

Перевод сделали специалисты Бюро переводов «Адванс»

Адрес:      ул. Гоголя 25-А, г.Севастополь,

Украина, 99011 

Телефон: +38 (095) 388-00-58    

                    +38 (067) 895-22-50

                    +38 (044) 36-0-37-38 (Киев)

                    +38 (057) 780-2-790 (Харьков)

                    +38 (0692) 942-946 (Севастополь)

Режим:     09.00 – 18.00 (будние дни);

09.00 - 13.00 (суббота)

E-mail:      info@advance-translation.com

ICQ:          572577016

Skype:     advance-trans